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关键词1

第一章 组织培养技术及细胞生物学检测1

第一节组织培养的基本技术1

一、培养用品的清洗和消毒灭菌1

二、无菌操作4

三、培养用液5

四、组织细胞的分离与培养8

五、传代培养10

六、一些特殊培养法10

第二节特殊细胞和组织的培养11

一、上皮细胞原代培养11

二、中胚层细胞的培养15

三、神经组织细胞培养16

四、巨噬细胞的培养16

第三节细胞克隆化培养17

一、有限稀释法17

二、平皿克隆分离法18

三、单细胞显微操作法18

第四节细胞培养污染的检测和排除19

一、污染途径19

二、污染对细胞的影响20

三、微生物污染的检测和防治20

第五节细胞生物学和遗传学检测21

一、相差显微镜观察21

二、细胞计数22

三、接种存活率测定23

四、细胞生长曲线和倍增时间测定24

五、细胞分裂指数测定25

六、细胞周期参数的测定26

七、克隆形成率测定27

八、裸鼠接种致瘤实验28

九、染色体核型分析29

第二章 分子生物学实验基本技术31

第一节质粒和噬菌体DNA的制备31

一、质粒DNA的小量制备31

二、质粒DNA的大量制备33

三、质粒DNA的纯化和保存34

四、噬菌体DNA的制备37

第二节原核细胞核酸的制备39

一、原核细胞基因组DNA的制备39

二、原核细胞基因组RNA的制备41

第三节真核细胞基因组核酸的制备43

一、真核细胞基因组DNA的制备43

二、真核细胞总RNA的制备48

第四节核酸的纯化及定量51

一、核酸的纯化51

二、核酸的定量53

第五节凝胶电泳54

一、琼脂糖凝胶电泳55

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳59

三、脉冲场凝胶电泳61

第六节核酸的酶学操作62

一、限制性内切酶的酶学分析62

二、其他常用酶类66

第三章 核酸分析技术70

第一节核酸分子探针的标记70

一、核酸分子探针的来源70

二、核酸分子探针的标记71

第二节核酸杂交技术78

一、滤膜印迹杂交79

二、液相杂交技术91

三、核酸原位杂交95

第三节DNA序列测定101

一、测序策略102

二、末端终止法104

三、Maxam-Gilbert DNA化学降解法118

第四节基因突变分析技术121

一、限制性片段长度多态性122

二、以聚合酶链反应为基础的突变检测技术123

三、单核苷酸多态性127

四、其它方法128

第四章 聚合酶链式反应130

第一节原理130

一、DNA模板的变性130

二、模板与引物的结合130

三、引物延伸131

第二节PCR反应的成分和作用131

一、耐热DNA聚合酶131

二、缓冲液133

三、dNTP133

四、模板核酸133

五、引物134

第三节引物设计一般性原则134

一、引物长度134

二、G+C含量134

三、碱基分布的随机性134

四、引物自身135

五、引物之间135

六、引物的3′端135

七、引物的5′端135

八、引物的特异性135

第四节PCR相关技术135

一、通用PCR135

二、RT-PCR137

三、多重PCR137

四、套式PCR137

五、PCR结合特异寡核苷酸探针斑点杂交法138

六、PCR－限制性片断长度多态性分析138

七、任意引物PCR138

八、PCR－单链构象多态性分析139

九、原位PCR139

第五节PCR产物纯化、回收、定量、克隆及测序140

一、PCR产物纯化、回收140

二、PCR产物的定量141

三、PCR产物的克隆141

四、PCR产物的测序142

第五章 基因克隆143

第一节基因克隆策略143

一、全基因组扫描基因定位策略143

二、定位－候选克隆和计算机克隆策略145

三、基因表达差异克隆策略146

第二节cDNA文库的构建及筛选147

一、cDNA文库的构建147

二、cDNA文库筛选149

第三节差异表达的基因克隆方法151

一、mRNA差异显示法151

二、抑制性消减杂交155

第四节cDNA全长克隆方法158

一、cDNA末端快速扩增技术158

二、染色体步移法167

三、EST介导的基因克隆171

第六章 DNA重组技术172

第一节DNA重组技术的定义及步骤172

一、目的基因的制备172

二、载体的构建173

第二节细菌感受态的制备和质粒的转化177

一、菌株的培养、保存和复苏177

二、感受态细胞的制备177

三、细菌的转化178

第三节DNA重组反应179

一、粘端连接179

二、平端连接180

三、定向连接181

第四节含重组质粒的细菌菌落的鉴定181

一、a互补181

二、插入失活182

三、菌落原位杂交183

四、限制酶酶切分析184

五、DNA序列测定184

第七章 基因转染技术185

第一节物理化学法185

一、磷酸钙沉淀法185

二、DEAE－葡聚糖介导法188

三、电穿孔法189

四、脂质体介导法191

第二节病毒载体法193

一、逆病毒载体法193

二、腺病毒载体法200

第三节转染细胞的筛选与分离203

一、哺乳动物细胞常用的遗传选择标记204

二、利用G418筛选和分离转染的细胞206

第八章 真核基因表达分析208

第一节体内表达系统208

一、主要设备209

二、主要试剂209

三、获得胚胎209

四、去除胶状外膜和卵黄膜211

五、显微注射211

六、动物帽切割和培养212

第二节体外表达系统212

一、四环素基因表达系统213

二、荧虫酶216

三、绿色荧光蛋白217

第三节真核基因表达调控研究方法220

一、DNase-Ⅰ超敏感性分析221

二、DNA甲基化分析223

三、引物延伸法确定转录的起始位点224

四、体外转录224

五、进行中的核转录分析225

六、氯霉素乙酰基转移酶分析225

七、凝胶滞留分析227

八、Southwestern印迹227

九、DNA足迹分析228

十、DNA结合蛋白的分离纯化229

十一、酵母双杂交230

第九章 基因表达蛋白质的检测与分析231

第一节蛋白质的体外表达231

一、蛋白质在大肠杆菌中的表达231

二、蛋白质在真核细胞中的表达234

第二节表达蛋白的纯化237

一、细菌裂解238

二、包涵体的洗涤与纯化239

三、包涵体的溶解240

四、蛋白质的复性241

五、融合蛋白的定点裂解241

六、融合蛋白的纯化244

第三节抗体制备和纯化246

一、多克隆抗体制备246

二、单克隆抗体制备248

三、盐析法纯化免疫球蛋白250

四、DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白252

五、Sepharose CL-4B亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类254

六、高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体255

第四节免疫学检测256

一、免疫酶技术256

二、免疫组织化学258

三、放射免疫技术262

四、免疫斑点试验264

五、免疫沉淀法265

六、Western印迹法267

第五节蛋白质组学技术270

一、蛋白质组学简介270

二、蛋白质组学研究常用的技术方法272

三、蛋白质组学研究技术目前存在的问题275

第十章 基因工程抗体277

第一节嵌合抗体277

一、构建嵌合抗体的基本原理277

二、方法278

第二节改形抗体279

一、构建改形抗体的一般性原则279

二、改形抗体可变区基因的构建与表达280

第三节抗体库技术283

一、基本原理283

二、方法284

第四节基因工程抗体的纯化和鉴定299

一、抗体的纯化299

二、抗体活性的测定300

三、抗体亲和力的测定300

四、抗体可变区基因序列测定及分析301

第十一章 DNA芯片技术303

第一节DNA芯片的制作原理303

一、载体材料的选择304

二、DNA方阵的构建方法304

三、样品制备、杂交和检测304

第二节微阵列的选择306

第三节芯片技术在医学领域的应用307

一、测序307

二、基因表达水平的检测307

三、基因诊断308

四、基因芯片在肿瘤研究中的潜在用途308

五、药物筛选309

六、给药个性化309

七、检测基因突变和多态性310

第四节芯片技术存在的问题和前景311

一、存在问题311

二、进展312

第十二章 基因工程小鼠317

第一节胚胎干细胞317

一、实验材料318

二、ES细胞的培养319

第二节转基因小鼠328

一、微注射DNA的制备与纯化329

二、转基因鼠的构建方法330

三、转基因鼠系的建立335

第三节基因敲除／敲入小鼠335

一、基因打靶载体的构建336

二、将打靶载体转入受体细胞中346

三、用选择性培养基筛选已击中细胞346

四、基因打靶细胞鉴定工作347

五、产生嵌合体动物和基因打靶动物347

第四节核移植技术348

一、供体细胞准备350

二、受体细胞的准备和移核351

三、去核卵母细胞与供体细胞融合351

四、移核后卵母细胞的激活353

五、核移植重构胚的体外培养353

六、克隆胚胎的移植354

第十三章 生物信息学356

第一节概论356

一、生物信息数据库357

二、生物信息学软件363

三、生物信息学资源365

第二节基因组生物信息学366

一、序列比对与数据库搜索368

二、基因识别377

三、序列翻译与ORF预测379

四、蛋白质基序和结构域识别380

五、蛋白3D同源模型构建382

六、限制性酶切图谱383

七、引物设计383

第三节蛋白质组信息学386

一、蛋白质组信息学386

二、蛋白质组信息学相关资源390

附录一分子生物实验室的常规仪器及设施392

附录二放射性核素的基本知识404

附录三细胞培养室411

附录四常用试剂的配制416

附录五常用单位换算425

附录六在线生物软件介绍427

附录七英汉医学分子生物学常用缩略语432

附录八主要参考文献456