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绪论（李校堃 袁辉）1

0.1 蛋白质提取1

0.1.1 原材料的选择1

目录1

0.1.2 提取方法2

0.2 色谱6

0.2.1 吸附剂的选择6

0.2.2 预实验6

0.2.3 色谱顺序6

0.3 分析和检测7

0.3.1 电泳7

0.3.2 分级分离的监控7

0.3.3 活性测定8

0.4 纯化策略9

0.3.4 蛋白质含量的确定9

0.4.1 三步纯化策略11

0.4.2 色谱技术的顺序12

0.4.3 纯化的要求14

0.5 冷冻干燥保存15

0.6 规模放大的指导方针15

第1部分 分离纯化方法17

第1章 离心（袁辉 武育荣）17

1.1 原理和分类17

1.1.1 基本原理17

1.1.2 分类20

1.1.3 分析性超速离心24

1.2 应用实例25

1.2.1 应用超速离心法分离血浆脂蛋白25

1.2.2 Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞26

1.3 标准操作和注意事项27

1.3.1 关于密度离心法梯度溶液的制备27

1.3.2 超离心后样品的收集28

1.3.3 关于连续流离心机操作的问题解答28

1.3.4 离心机的常见故障及其排除30

第2章 细胞破碎（谢秋玲 洪岸）32

2.1 细胞的结构32

2.1.1 细菌的结构32

2.1.2 酵母的结构32

2.1.3 动物细胞的结构32

2.1.4 植物细胞的结构32

2.2 破碎缓冲液33

2.3 破碎的方法33

2.3.1 机械法33

2.3.2 非机械法36

2.4 影响破碎率的因素和检测破碎率的方法37

2.4.1 影响因素37

2.4.2 检测方法38

2.5 破碎仪器38

2.5.1 珠磨机38

2.5.2 高压均质机39

2.6 破碎实例40

2.6.1 破碎材料40

2.6.2 破碎仪40

2.6.3 破碎方法40

2.6.4 仪器的清洗41

2.6.5 注意事项41

参考文献41

3.1.1 盐析法沉淀的原理42

3.1 盐析法沉淀42

第3章 蛋白质沉淀（张玲 袁辉 洪岸）42

3.1.2 盐析的影响因素44

3.1.3 操作步骤44

3.2 有机溶剂沉淀45

3.3 聚合物沉淀46

3.4 等电点沉淀47

3.5 选择性变性沉淀47

3.5.1 温度变性47

3.5.2 pH变性48

3.5.3 有机溶剂变性48

第4章 溶液的制备和膜过滤（谢秋玲 袁辉 李校堃）49

4.1 缓冲液49

4.1.1 简介49

4.1.2 缓冲液的制备52

4.1.3 缓冲液的更换56

4.2 膜过滤58

4.2.1 微过滤58

4.2.2 标准流动净化59

4.2.3 超滤59

4.2.4 病毒过滤60

4.2.5 高效切线流动过滤60

4.2.6 膜色谱61

4.3 应用实例61

4.3.1 血浆制品61

4.3.2 血清62

4.3.3 哺乳动物培养63

4.3.4 注释66

4.4 术语67

参考文献67

5.1 基本概念和种类68

第5章 色谱技术导论（袁辉 李校堃）68

5.2 固定相70

5.2.1 基质特性70

5.2.2 固定相技术72

5.2.3 配基介绍73

5.2.4 配体-蛋白质相互作用73

5.3 色谱理论75

5.3.1 色谱的量单位75

5.3.2 在吸附色谱中的保留78

5.4 色谱过程81

5.4.1 装柱81

5.4.2 加样82

5.4.3 色谱的洗脱82

5.5.1 色谱系统83

5.5 仪器设备83

5.5.2 色谱系统的部件85

参考文献88

第6章 凝胶排阻色谱（袁辉 钱垂文）90

6.1 简介90

6.2 基质选择91

6.2.1 可用基质特性91

6.2.2 化学和吸附特性93

6.2.3 选择曲线和分离范围94

6.2.4 基质孔体积94

6.3 理论考虑95

6.3.1 通过凝胶过滤估算分子大小95

6.3.2 柱效和峰区带扩展96

6.3.3 影响分辨率的参数98

6.4.2 装柱过程100

6.4.1 柱材料及附件100

6.4 装柱100

6.4.3 装柱质量的评价101

6.4.4 装柱落差压102

6.5 样品与缓冲液103

6.5.1 缓冲液与添加剂103

6.5.2 样品104

6.5.3 校正物质104

6.6 凝胶排阻色谱系统105

6.6.1 上样105

6.6.2 洗脱105

6.6.3 最佳流速106

6.6.4 样品检测107

6.7.2 蛋白质混合物组分收集——抗IgE-β-半乳糖苷酶结合物的纯化108

6.7.1 脱盐——大量血红蛋白样品脱盐108

6.7 应用实例108

6.6.5 系统（弥散）扩散108

6.7.3 凝胶过滤分析——葡萄球菌肠毒素B的纯化监测，小鸡干扰素分子质量的确定109

6.7.4 孔径大小的确定——Superose？6表观孔直径的估算111

6.7.5 混合模式分离——酵母菌细胞色素氧化酶的初始纯化112

6.8 凝胶过滤部分所使用的公式和符号113

6.9 分子质量标准品114

参考文献115

第7章 离子交换色谱（袁辉 钱垂文）119

7.1 离子交换色谱的原理120

7.2 离子交换色谱的基本概念121

7.2.1 离子交换色谱的分辨率121

7.2.2 容量因子122

7.2.3 柱效122

7.2.5 容量123

7.2.4 选择性123

7.3 离子交换剂的种类124

7.4 样品准备125

7.4.1 样品浓度125

7.4.2 样品组成125

7.4.3 样品体积126

7.4.4 样品黏度126

7.4.5 样品制备126

7.5 柱装填126

7.5.1 柱构造126

7.5.2 柱装填录像126

7.5.3 检查填充126

7.6.1 阴离子交换树脂交换容量的测定127

7.6.2 阳离子交换树脂交换容量的测定127

7.6 交换容量的测定127

7.7 离子交换介质的清洗和储存128

7.7.1 再生128

7.7.2 清洗、清洁和灭菌工艺128

7.7.3 凝胶和柱的储存128

7.8 离子交换色谱的应用策略129

7.8.1 结合条件129

7.8.2 容量129

7.8.3 起始条件129

7.8.4 pH130

7.8.5 离子强度130

7.8.6 上样130

7.8.7 洗脱130

7.8.8 梯度形状的选择131

7.8.9 流速131

7.8.11 规模放大132

7.8.10 缓冲液的配制132

7.9 应用实例133

7.9.1 酶133

7.9.2 免疫球蛋白133

7.9.3 核酸分离133

7.9.4 多肽和多核苷酸133

7.10 常见问题及其解决135

第8章 亲和色谱（袁辉）138

8.1 亲和色谱的动力学139

8.1.1 结合平衡：非选择性洗脱139

8.1.2 结合平衡：选择性洗脱或者竞争性洗脱140

8.1.3 竞争性洗脱的结果141

8.1.4 吸附和解吸附的动力学141

8.2 亲和色谱载体142

8.3 载体的处理143

8.3.1 载体的活化143

8.3.2 配体偶联143

8.3.3 间隔臂144

8.3.4 封闭144

8.4 洗脱策略144

8.4.1 洗脱方法的选择144

8.4.2 流速145

8.4.3 举例146

8.5 亲和色谱操作147

8.5.1 预处理147

8.5.2 柱的填充和制备148

8.5.3 上样注意事项148

8.6.1 产物变性149

8.6 亲和色谱存在的问题149

8.5.4 洗涤149

8.5.5 洗脱149

8.6.2 渗漏150

8.6.3 成本152

8.7 基质的选择152

8.7.1 配体的特性154

8.7.2 亲和吸附剂制备的评价154

第9章 羟基磷灰石色谱（袁辉 朱利民）157

9.1 原理158

9.1.1 蛋白质结合的机理158

9.1.2 洗脱行为158

9.2.1 双梯度筛选159

9.2.3 优点159

9.2.2 增强抗体的溶解性159

9.2 方法的开发159

9.1.4 BSA和IgG结合容量159

9.1.3 保留时间和缓冲液pH159

9.3 特性160

9.3.1 羟基磷灰石的特性160

9.3.2 化学稳定性160

9.4 比较161

9.5 压降计算器162

9.6 柱填充：中试和工艺柱163

9.7 应用案例164

9.7.1 抗肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞抗原的纯化165

9.7.2 马IgGT抗蛇毒血清的纯化166

9.7.3 从转基因乳中纯化重组人αl抗胰蛋白酶169

9.7.4 IgG的纯化171

9.7.5 转基因IgG纯化173

10.1.3 蛋白质的等电点与聚焦效应的关系175

10.1.2 聚焦介质的聚焦175

10.1.1 pH梯度的形成175

10.1 原理175

第10章 色谱聚焦（张玲）175

10.1.4 解吸附效应176

10.2 色谱聚焦介质176

10.3 色谱聚焦缓冲液177

10.3.1 起始缓冲液177

10.3.2 样品缓冲液177

10.3.3 洗脱缓冲液177

10.4 色谱聚焦应用实例——昆虫谷胱甘肽S-转移酶的分离纯化177

第11章 逆流色谱（张天佑）179

11.1 基础知识179

11.1.1 发展史179

11.1.2 逆流分溶法简介179

11.2.1 引言180

11.2 仪器——螺旋管行星式离心分离仪180

11.2.2 实现逆流过程的机制181

11.2.3 分离实例182

11.2.4 各个物理参数对分离效果的影响183

11.3 大分子蛋白质逆流色谱法186

11.3.1 引言186

11.3.2 聚合物水相系统的基本特征186

11.3.3 大分子在聚合物水相系统中的分配188

11.3.4 聚合物水相系统用于逆流分配192

11.3.5 正交轴逆流色谱仪192

11.3.6 正交轴逆流色谱法分离生物大分子196

11.4 结语200

附录 中国开展逆流色谱技术及应用研究的进程201

参考文献204

12.1 介绍205

第2部分 分离纯化技术的应用205

第12章 膜蛋白的纯化策略（李校堃 袁辉 华子春）205

12.2 保持催化活性的常用策略206

12.3 分离技术的选择206

12.4 选择蛋白质来源和细胞裂解的方式207

12.5 蛋白质活性实验208

12.5.1 催化活性和其他特性测试208

12.5.2 总蛋白质定量测试209

12.6 膜蛋白的溶解和稳定209

12.6.1 缓冲液的选择209

12.6.2 去垢剂的选择210

12.6.3 蛋白质稳定性和蛋白酶的抑制213

参考文献214

13.2 溶解-沉淀216

13.2.1 差分萃取216

13.1 介绍216

第13章 膜蛋白纯化中的色谱技术和基本操作（李校堃 袁辉 杨树林）216

13.2.2 相分离和级分沉淀218

13.2.3 离心219

13.3 样品的富集、缓冲液体系的改变以及去垢剂的去除和交换220

13.3.1 样品富集220

13.3.2 缓冲液体系的改变220

13.3.3 去垢剂的去除和交换221

13.4 色谱技术221

13.4.1 羟基磷灰石色谱222

13.4.2 离子交换色谱224

13.4.3 色谱聚焦226

13.4.4 金属螯合色谱229

13.4.5 亲和色谱230

13.4.6 共价色谱232

13.4.8 凝胶过滤233

13.4.7 疏水作用色谱233

参考文献235

第14章 重组蛋白质的包涵体纯化（张玲）237

14.1 细胞破碎237

14.2 包涵体表达与可溶性表达238

14.2.1 增加可溶性表达的策略238

14.2.2 药物蛋白以包涵体表达238

14.3 包涵体复性240

14.3.1 复性机理240

14.3.2 复性过程中促复性添加剂240

14.3.3 体外复性中应注意的操作参数242

14.3.4 复性方法242

14.3.5 复性蛋白质的检测技术243

实例2 异源二聚体血小板衍生的生长因子的复性244

14.4 包涵体体外复性过程实例244

实例1 重组人尿激酶原体外复性244

参考文献245

第15章 植物蛋白质的分离纯化（于荣敏）246

15.1 组织的选择246

15.2 组织破碎246

15.3 植物蛋白质纯化实例246

15.3.1 半夏蛋白的分离纯化247

15.3.2 从灵芝中提取生物活性肽247

15.3.3 植物超氧化物歧化酶的提取纯化249

实例 茶叶超氧化物歧化酶的制备249

15.3.4 木本植物蛋白质提取纯化249

参考文献250

16.2 组织破碎251

第16章 动物组织中的蛋白质纯化（李校堃 袁辉）251

16.1 组织的选择251

16.3 蛋白质意外降解的防止252

16.4 亚细胞组分的分级分离253

实例1 猪肾中亚细胞组分的分级分离253

实例2 猪肾中微粒体膜组分粗品的分离254

实例3 猪肾中微体膜组分的分离254

实例4 猪血的成分分级255

16.5 膜蛋白的溶解255

实例5 膜蛋白的溶解256

16.6 动物蛋白质纯化实例256

16.6.1 血管紧张肽转化酶的纯化256

实例6 利用Lisinopril-2.8nm-Sepharose亲和纯化血管紧张肽转化酶257

16.6.2 氨基肽酶P的纯化258

实例8 Alkyl-Superose疏水相互作用色谱259

实例7 使用DEAE-纤维素的大规模阴离子交换色谱259

实例9 Mono-Q阴离子交换色谱260

16.6.3 果糖-1,6-二磷酸酶的纯化260

实例10 果糖-1,6-二磷酸酶的纯化260

附录 处理未经筛选人组织的实验室规则261

参考文献261

第17章 从乳中纯化蛋白质（李校堃 袁辉）263

17.1 介绍263

17.2 乳蛋白263

17.2.1 胶粒结构263

17.2.2 主要的乳蛋白264

17.3 制备和处理乳时应考虑的因素266

17.3.1 乳的来源266

17.3.4 蛋白修饰267

17.3.5 干燥和储存267

17.3.2 蛋白质水解267

17.3.3 溶解性267

17.4 乳蛋白的分离268

17.4.1 酪蛋白和乳清蛋白的分离268

实例1 脱脂乳的制备269

实例2 酪蛋白沉淀269

实例3 利用溶解度差异分离各种酪蛋白270

17.4.2 利用溶解度差异分离乳蛋白270

实例4 β-LG的盐析分离270

17.5 色谱法分离纯化乳蛋白271

17.5.1 离子交换色谱271

实例5 酪蛋白的阳离子交换色谱272

17.5.2 大小排阻色谱法273

17.5.4 反相色谱274

17.5.5 色谱聚焦274

17.5.3 亲和色谱274

实例6 乳清蛋白的排阻色谱274

17.6 鉴定和纯度分析275

17.6.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳275

实例7 乳蛋白的PAGE分析275

17.6.2 等电聚焦277

17.6.3 毛细管电泳277

17.6.4 分析色谱277

17.6.5 质谱分析278

17.7 进展278

17.7.1 制备性电泳278

17.7.2 微过滤和超滤279

17.7.3 双水相分离279

18.1.1 简介280

18.1 蛋白质纯化后的保存280

第18章 蛋白质的保存和真空冷冻干燥（袁辉 郑效东）280

第3部分 蛋白质的保存与检测280

18.1.2 物质281

18.1.3 方法281

18.2 真空冷冻干燥的原理与技术288

18.2.1 冻干机的组成288

18.2.2 冷冻干燥的程序291

18.2.3 共熔点及其测量方法292

18.2.4 产品的预冻292

18.2.5 产品的第一阶段干燥293

18.2.6 产品的第二阶段干燥294

18.2.7 影响冻干过程的因素295

18.2.8 冻干曲线和时序的制定296

18.2.9 冻干的后处理297

19.1.1 考马斯亮蓝染色299

19.1 凝胶直接染色299

第19章 蛋白质检测方法（蔡绍晖 李校堃）299

19.1.2 银染色法300

19.1.3 试剂与溶液配方303

19.2 印迹膜上蛋白质的染色303

19.2.1 印度墨汁染色304

19.2.2 胶体金染色304

19.2.3 蛋白质染色的碱化法305

19.2.4 试剂与溶液配方305

19.3 免疫印迹与免疫检测305

19.3.1 免疫印迹305

19.3.2 免疫检测310

19.3.3 显影反应312

19.3.4 膜剥离和再利用314

19.3.5 试剂和溶液配方314

19.3.7 关键技术问题316

19.3.6 应用316

参考文献319

第20章 等电聚焦（李校堃 袁辉 华子春）321

20.1 简介321

20.2 材料321

20.2.1 设备321

20.2.2 耗材、化学试剂和溶液321

20.3 方法322

20.3.1 凝胶制备322

20.3.2 加样323

20.3.6 区带的收集324

20.3.7 从载体两性电解质中分离蛋白质324

20.4 注释324

20.3.5 pH梯度的测量324

20.3.4 蛋白质区带的检测324

20.3.3 等电聚焦324

参考文献325

附录1 蛋白质质量检定327

1-1 蛋白质含量测定327

1-2 白蛋白（或免疫球蛋白）纯度测定（醋酸纤维素薄膜电泳法）328

1-3 残留聚乙二醇（PEG）含量测定329

1-4 人血白蛋白多聚体含量及人免疫球蛋白中IgG单体加二聚体含量测定（高压液相色谱法）330

1-5 外源性DNA残留量测定331

1-6 等电点测定332

1-7 大肠杆菌菌体蛋白残留含量测定335

1-8 肽图分析（胰蛋白酶裂解法）336

1-9 紫外光谱测定337

1-10 荚膜多糖抗原分子大小测定（琼脂糖4B柱色谱法）337

1-11 免疫球蛋白类制品糖含量测定（高压液相色谱法）338

1-12 O-乙酰基含量测定339

1-14 核糖含量测定340

1-13 核酸含量测定340

1-15 氨苄青霉素残留量测定341

1-16 聚山梨酯-80残留量测定342

1-17 pH测定（电位法）342

1-18 硫酸铵含量测定343

1-19 氯化钠含量测定343

1-20 钠离子含量测定（火焰光度法）344

1-21 钾离子含量测定（火焰光度法）344

1-22 游离甲醛测定345

1-23 磷含量测定346

1-24 费休（K.Fischer）水分测定347

1-25 磷酸三丁酯残留量测定（气相色谱法）348

1-26 硫柳汞及硝酸汞苯含量测定349

1-27 氯仿含量测定350

1-28 苯酚含量测定351

1-29 氢氧化铝（或磷酸铝）含量测定352

1-30 枸橼酸离子含量测定352

1-31 亚硫酸氢钠含量测定353

1-32 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳354

附录2 蛋白质的转换357

附录3 柱压的转换357

附录4 线性流速和体积流速的互换358

4-1 从线性流速到体积流速的换算358

4-2 从体积流速（ml/min）到线性流速（cm/h）的换算358

4-3 从体积流速（ml/min）到使用注射器的换算358

附录5 氨基酸表359

附录6 填柱（适合于吸附色谱）361

中文索引362

英文索引369