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第一章 细胞与生物技术基础1

第一节 细胞生物学1

一、细胞生物学研究内容与现状1

二、细胞生物学发展史3

三、细胞生物学技术4

第二节 细胞分子生物学6

一、细胞分子生物学的发展6

二、细胞分子生物学技术6

第三节 细胞工程7

一、基本概念7

二、细胞工程的发展进程7

三、细胞工程技术7

四、展望9

第二章 细胞显微观测技术10

第一节 细胞显微技术10

一、光学显微镜10

二、电子显微镜23

三、扫描探针显微镜32

第二节 细胞超微标记示踪技术38

一、电镜细胞化学39

二、免疫电镜技术51

三、电镜原位杂交技术64

第三章 细胞检测技术69

第一节 流式细胞仪检测技术69

一、流式细胞仪的工作原理和基本操作69

二、流式细胞术样品制备技术71

三、细胞免疫荧光染色技术74

四、细胞分选技术77

第二节 细胞化学和免疫细胞化学79

一、细胞化学79

二、免疫细胞化学85

第三节 细胞增殖与凋亡100

一、细胞增殖100

二、细胞凋亡106

第四章 细胞的培养与分离技术121

第一节 细胞培养基本方法和技术121

一、细胞的原代培养121

二、细胞的传代培养124

三、细胞的冻存与复苏125

四、细胞计数与成活率检测126

五、培养物污染的判断及防止127

第二节几种特殊细胞的培养与分离130

一、神经元细胞的培养与分离130

二、肝细胞的培养与分离131

三、星状细胞的培养与分离133

四、上皮细胞的培养与分离135

五、内皮细胞的培养与分离137

六、肿瘤细胞的培养与分离138

第五章 细胞器的分离与制备技术140

第一节 细胞膜140

一、从悬浮细胞中制备细胞膜140

二、从组织培养皿中的汇合或部分汇合细胞中分离顶层膜、基底膜或中间膜142

三、从生长于微载体上的细胞中分离细胞膜143

第二节 桥粒144

一、从牛舌或牛口鼻部分离桥粒144

二、分级分离桥粒145

第三节 细胞质145

一、网织红细胞和红细胞胞质液的制备145

二、用培养细胞制备胞质液146

第四节 线粒体146

一、从肝脏中分离线粒体147

二、从组织培养细胞中分离线粒体147

第五节 高尔基体148

一、从大鼠肝脏中分离高尔基复合体148

二、从培养的哺乳动物细胞中分离高尔基体149

第六节 粗微体150

一、从狗的胰脏中制备粗微体150

二、从组织培养细胞中制备粗微体152

第七节 核糖体154

第八节 细胞核155

一、从肝脏组织中制备细胞核155

二、用渗透溶胀法从H eLa细胞悬浮培养物中制备细胞核156

三、活化剂裂解方法从悬浮培养的H eLa细胞中制备细胞核157

第九节 细胞核基质158

一、从培养细胞中制备细胞核基质158

二、从组织中分离制备细胞核基质159

第十节 核仁160

一、从大鼠肝脏中分离核仁160

二、从HeLa细胞中分离核仁161

第十一节 微管162

一、通过组装/解聚从缺少组装驱动成分的缓冲液中分离微管163

二、在紫杉醇存在时通过组装的方法分离微管164

第十二节 中间丝164

一、从培养的细胞中分离Ⅰ～Ⅲ型中间丝165

二、从组织中分离中间丝（从牛舌上皮分离角蛋白中间丝）166

第六章 细胞的诱导分化技术167

第一节 正常细胞的诱导分化167

一、小鼠气管上皮细胞的诱导分化167

二、视神经节细胞的诱导分化169

第二节 肿瘤细胞的诱导分化171

一、环腺苷酸对脑胶质瘤细胞的诱导分化173

二、红景天苷对人肝癌细胞的诱导分化作用174

三、5-氮杂脱氧胞苷增强苯丁酸钠对急性髓系白血病细胞的诱导分化176

第三节 干细胞的诱导分化177

一、胚胎干细胞的诱导分化178

二、神经干细胞的诱导分化179

三、髓造血干细胞的诱导分化181

四、间充质干细胞的诱导分化183

五、视网膜干细胞的诱导分化184

六、表皮干细胞的诱导分化186

七、肝脏干细胞的诱导分化188

八、胰腺干细胞的诱导分化189

九、肌肉干细胞的诱导分化192

十、小肠黏膜干细胞的诱导分化194

十一、肿瘤干细胞的诱导分化196

第七章 干细胞分离与培养技术198

第一节 胚胎干细胞198

一、小鼠胚胎干细胞的分离培养198

二、人胚胎干细胞的分离培养199

三、饲养层细胞的分离201

四、胚胎干细胞的传代202

第二节 成体干细胞204

一、人体MSC （hMSC）的培养204

二、采用hMSC制作人工心脏瓣膜205

三、采用hMSC制作人工骨206

第八章 细胞内基因的导入208

第一节 物理方法209

一、电穿孔转染法209

二、细胞显微注射技术210

三、基因枪转染法213

第二节 化学方法214

一、磷酸钙沉淀法214

二、脂质体介导DNA转染法215

三、DEAE-葡聚糖转染法216

四、阳离子聚合物转染法216

第三节 生物方法217

一、逆转录病毒载体转染法217

二、腺病毒载体转染法218

三、腺相关病毒载体转染法219

第九章 哺乳动物细胞RNAi技术221

第一节siRNA的设计221

第二节siRNA的制备228

一、化学合成方法229

二、T7RNA聚合酶体外转录合成dsRNA和siRNA230

三、用RNase Ⅲ消化长片段双链RNA制备siRNA234

四、siRNA表达质粒载体和病毒载体240

五、siRNA表达框246

第三节siRN A导入哺乳动物细胞247

一、脂质体248

二、多肽-MPG转染251

三、磁介导转染技术253

第四节siRNA文库255

一、随机siRNA文库255

二、已知基因RNAi文库258

第十章 细胞内基因的检测262

第一节 外源基因表达的转录水平检测262

一、Northern印迹技术262

二、RT-PCR技术265

三、实时定量PCR技术267

第二节 外源基因表达的翻译水平检测268

一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法269

二、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳272

三、蛋白质印迹275

四、Eastern印迹276

五、酶联免疫分析技术277

六、免疫沉淀技术279

七、蛋白质芯片技术281

八、蛋白质生物功能测定法282

第十一章 染色体检测技术284

第一节 染色体标本的制备284

一、染色体标本的常规制片方法284

二、空气干燥法284

第二节 细胞染色体显带技术286

一、染色体C带分带技术286

二、染色体G带分带技术287

三、染色体Q带分带技术288

四、染色体R带分带技术288

五、姐妹染色单体分化染色技术289

六、染色体银染方法290

七、高分辨G带技术291

第三节 细胞染色体的原位杂交292

一、标本的制备技术293

二、原位杂交技术294

三、与染色体分带技术的结合295

第十二章 细胞信号通路的检测方法296

第一节 体内信号转导通路的检测——顺式报告系统296

第二节 体内信号转导通道的检测——反式报告系统299

第三节 化学免疫检测方法302

第四节 磷酸化蛋白激酶免疫沉淀检测303

第十三章 细胞与重组病毒载体的生产306

第一节 腺病毒的制备方法306

一、腺病毒制备系统的概述306

二、细胞内同源重组法制备腺病毒载体306

三、细胞外同源重组法制备腺病毒载体308

四、腺病毒载体的大规模扩增310

五、重组腺病毒的鉴定311

第二节 腺相关病毒的制备方法313

一、293细胞/三质粒生产系统314

二、AAV包装细胞系的建立和AAV的生产316

三、AAV生产细胞系系统318

四、 rHSV辅助质粒生产系统321

第三节 单纯疱疹病毒载体的制备323

一、辅助病毒依赖性HSV扩增子载体生产工艺323

二、以黏粒为基础生产重组单纯疱疹病毒324

三、Cre-loxP重组系统生产HSV-1扩增子载体327

四、利用微载体生产重组单纯疱疹病毒载体330

五、利用生物反应器规模化生产重组HSV载体332

第四节 逆转录病毒载体制备方法334

一、依赖于包装细胞系的稳定生产方法334

二、多质粒共转染的瞬时生产方法337

第十四章 细胞融合与单克隆抗体338

第一节 细胞融合338

一、细胞融合技术338

二、杂交细胞的筛选341

第二节 单克隆抗体的生产技术345

一、动物的选择以及免疫345

二、杂交瘤细胞的融合与筛选347

三、单克隆抗体的筛选检测350

四、杂交瘤细胞的克隆化培养355

五、杂交瘤细胞鉴定、冻存与复苏357

六、单克隆抗体的大量制备359

七、单克隆抗体的纯化360

八、单克隆抗体的鉴定361

九、单克隆抗体的标记364

第十五章 治疗性克隆技术369

第一节 细胞核移植技术370

一、罗斯林技术370

二、檀香山技术372

第二节 体细胞重编程技术373

一、体细胞与多能干细胞融合技术373

二、体细胞与多能干细胞的提取物共孵育技术373

三、特定基因的表达诱导技术375

第十六章 细胞生物技术的应用379

第一节 医疗检测379

一、分子生物学检测技术379

二、免疫学检测技术386

第二节 细胞大规模高效培养技术的工业应用388

一、疫苗的生产388

二、基因重组蛋白药物的生产390

第三节 干细胞移植在疾病治疗中的应用392

一、BDNF（脑源性神经营养因子）基因修饰的人骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病392

二、hIGF-1基因修饰骨髓间充质干细胞移植修复兔关节软骨缺损400

三、骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死406

四、人胰腺干细胞在糖尿病治疗中的应用411

参考文献416